ICB療法によってCAR-T細胞機能が回復するメカニズムは不明だった
東京医科大学は1月13日、超解像イメージング法を用い、T細胞の働きを減弱する免疫チェックポイント分子PD-1 が CAR-T細胞の抗腫瘍効果を抑制するメカニズムを、1細胞1分子レベルで解明したと発表した。この研究は、同大免疫学分野の横須賀忠主任教授、町山裕亮准教授、大学院医学研究科博士課程の吉田洋輔医師、腎臓内科学分野の菅野義彦主任教授らの研究グループによるもの。研究成果は、「Communications Biology」のオンライン版に掲載されている。
画像はリリースより
免疫チェックポイント阻害（immune checkpoint blockade：ICB）療法の登場により、がん治療の選択肢が劇的に広がった。同時に、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）-T細胞療法や二重特異性抗体療法など、他のがん免疫療法も飛躍的に進歩している。どのがん免疫療法でも主役となる免疫細胞が、直接腫瘍細胞に接着して殺すことができるT細胞である。
そのT細胞を体外で増幅させ、患者に戻す治療法が「養子免疫療法」である。T細胞に腫瘍抗原を認識できる受容体「CAR」を遺伝子導入する「CAR-T細胞療法」は、その進化形といえる。CARは、腫瘍抗原を認識する外側の抗体部分と、T細胞の中に腫瘍の情報を伝える細胞内の部分とをつないだ人工的な受容体であり、患者から採取したT細胞に遺伝子導入することで、戻されたCAR-T細胞は、患者の体内で腫瘍細胞を見つけ出し、直接殺すことができる。日本でも、B細胞性白血病／リンパ腫の抗原となるCD19を標的とした「チサゲンレクルユーセル（製品名：キムリア）」や「タゲンシロルユーセル（製品名：イエスカルタ）」などが実用化されている。
一方で、CAR-T細胞療法は、固形腫瘍に対しては「がん微小環境」の免疫抑制やCARからの継続的なシグナル活性化に伴うT細胞の疲弊が壁となり、効果の持続と安全性の両立が大きな課題となっている。この免疫抑制を中心的に誘導する分子がPD-1であり、腫瘍や微小環境に発現するPD-L1と結合することで、TCRやCARから誘導される活性化シグナルをオフする。既に、ICB（抗PD-1／抗PD-L1抗体）療法はこの結合を遮断することでCAR-T細胞機能を回復させることが臨床的に明らかになっているが、CAR-T細胞に分子レベルでどのような変化が起こっているのか、メカニズムの精密な理解が求められていた。
CAR-T細胞活性化プロセスにおけるPD-1の挙動を1細胞・1分子レベルで可視化
今回の研究では、CAR-T細胞の活性化過程でPD-1がどのように振る舞い、どの分子を呼び込み、どのタイミングでシグナル伝達を抑えるのか、1細胞1分子レベルのライブイメージングで可視化・定量した。具体的には、B細胞抗原CD19を提示するガラス支持脂質二重膜（Glass-supported lipid bilayer：SLB）上にCD19標的CAR-T細胞を滴下し、SLBとCAR-T細胞との接着面にできるCAR凝集体（CARマイクロクラスター）とPD-1の動態を観察した。
T細胞は標的とする腫瘍細胞を見つけると接着し、「免疫シナプス」と呼ばれる細胞-細胞接着面を形成する。免疫シナプスには、腫瘍抗原を認識したTCRが数十個集まった「TCRマイクロクラスター」が200～300個形成され、腫瘍抗原の認識と腫瘍細胞の殺傷を行う活性化ユニットとして機能する。つまり、TCRマイクロクラスターがT細胞の機能を決定しているといえる。腫瘍細胞の細胞膜を模倣したSLBを用いることで、この微小な構造の1細胞1分子レベルでの観察が可能になる。
殺腫瘍効果に必要な「CARマイクロクラスター」形成をPD-1が阻害
まず、マウスCD8陽性細胞傷害性T細胞に、CD19 CARとPD-1を遺伝子導入したCD19 CAR-T細胞を作製した。さらに、CD19とPD-1のリガンド（PD-L1）を組み入れたSLBを準備し、その上にCD19 CAR-T細胞をのせ、CARとPD-1の挙動を観察した。
CD19 CAR-T細胞は、抗原であるCD19と結合して「CARマイクロクラスター」を形成した。また、SLB上にPD-L1が存在すると、PD-1と結合して「PD-1マイクロクラスター」を形成し、CARマイクロクラスターと共局在することが観察された。CAR-T細胞活性化の指標であるCD3ζのリン酸化は、PD-1マイクロクラスターの形成によって減弱し、T細胞の活性化を示す分子Erkのリン酸化（pErk）が低下していることがわかった。これは、「CAR-PD-1マイクロクラスター」を形成することにより、CARの活性シグナルが負に制御されたことを示している。
PD-1マイクロクラスターはSHP2を介してCAR-T細胞機能を抑制
次に、PD-1がどのような抑制分子をリクルートしてCARシグナルを抑制しているのかを解析した。通常、疲弊T細胞では、PD-1は脱リン酸化酵素であるSHP2をリクルートすることで、活性化シグナルを遮断することが知られている。研究グループはこれまでに、PD-1-PD-L1結合後、SHP2がTCR-PD-1マイクロクラスターにリクルートされることを見いだしている。
今回の研究では、CAR-T細胞においても、PD-1はPD-L1との結合に依存してSHP2を2分以内と極めて短い時間にCAR-PD-1マイクロクラスターへ集積させることを明らかにした。また、免疫沈降法による生化学的解析においても、PD-1とSHP2の物理的な相互作用が証明された。これらの知見は、SHP2がCAR-PD-1マイクロクラスターにリクルートされることで、CARの根幹となるCD3ζ鎖や下流のErkのリン酸化を直接的に解除し、強力なブレーキとして機能している可能性を強く示唆している。
PD-1を発現するCAR-T細胞は腫瘍抑制効果が減弱、担がんマウスで確認
続いて、このような分子レベルの抑制が、CAR-T細胞の実際の抗腫瘍効果にどう影響するかを検証した。PD-L1を発現する標的腫瘍細胞と共培養した実験では、PD-1を介した抑制により、CAR-T細胞からのIL-2やIFN-γといったサイトカインの産生が大幅に低下し、がん細胞に対する細胞傷害活性も減弱することが確認された。
さらに、担がんマウスモデルを用いた検討においても、PD-1を発現するCAR-T細胞群は、PD-1を持たない群に比べて腫瘍の増大を抑えることができず、生存期間も著しく短縮した。これにより、1分子レベルで観察された「CAR-PD-1マイクロクラスター」による抑制機構が、生体内においてもCAR-T細胞療法の治療効果を阻害する要因であることが実証された。
ICB抗体によりCAR-T細胞機能が回復、担がんマウスの生存期間も劇的に改善
最後に、PD-1による抑制をICBによって解除できるかを検討した。複数種類の抗PD-1抗体を添加したところ、抗体の濃度依存的にPD-1マイクロクラスターの形成が阻害され、これに相関してCAR-T細胞のサイトカイン産生能や抗腫瘍効果が回復した。
次に、担がんマウスモデルにおいても、抗PD-L1抗体の投与を行ったところ、生存成績の劇的な改善が確認された。
以上の結果は、ICB抗体がPD-1マイクロクラスターの形成を阻害することでCAR-T細胞のブレーキを外し、殺腫瘍効果を増強させることを裏付けるものである。
がん免疫療法の最適化や次世代CAR・新規薬剤開発への応用に期待
同研究により、CAR-T細胞においてPD-1がSHP2をリクルートし、抑制性マイクロクラスターを形成することで、CAR-T細胞の機能低下と抗腫瘍免疫の破綻を誘導しているというメカニズムが初めて可視化された。これは、CAR-T細胞の疲弊メカニズムの核心に迫る成果である。また、抗PD-1／PD-L1抗体の添加によって、このマイクロクラスターの形成を抑制できることが示された。
「今回確立したイメージング解析系は、CAR-T細胞療法と併用するICB抗体の種類の選定や、最適な投与量を決定するための『効果判定ツール』として応用ができる可能性がある。さらに、PD-1マイクロクラスターの形成自体を阻害するような、次世代のCARデザインや新規薬剤の開発への使用が期待される」と、研究グループは述べている。（QLifePro編集部）